Plasmide CRISPR d'Activation (h) RAMP2: sc-402546-ACT

La protéine modifiant l’activité des récepteurs 2 (RAMP2) est une sous-unité accessoire membranaire à passage unique qui façonne le trafic, la spécificité de ligand et la sortie de signalisation de certains complexes de RCPG de classe B, en particulier le récepteur apparenté au récepteur de la calcitonine (CLR). En permettant la formation d’un récepteur fonctionnel de l’adrénomédulline, RAMP2 module des programmes de signalisation dépendants de l’AMPc qui influencent l’homéostasie endothéliale, la perméabilité vasculaire, la biologie lymphatique et les réponses angiogéniques. La signalisation dépendante de RAMP2 recoupe des voies qui régissent la dynamique du cytosquelette, la régulation du tonus vasculaire liée au monoxyde d’azote et le remodelage inflammatoire. Une activité dérégulée de l’axe RAMP2/CLR–adrénomédulline a été impliquée dans des phénotypes cardiovasculaires et d’inflammation vasculaire, et est fréquemment étudiée dans le contexte de la dysfonction endothéliale et de l’intégrité de la barrière.

RAMP2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAMP2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RAMP2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAMP2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAMP2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RAMP2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAMP2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RAMP2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RAMP2 dans les cellules tumorales présentant une expression de RAMP2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.