RAMP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401396-ACT

Das rezeptoraktivitätsmodifizierende Protein 1 (RAMP1) ist eine membranständige Zubehöruntereinheit mit einer einzelnen Transmembrandomäne, die das Trafficking, die Ligandenspezifität und die Signalantwort von GPCR-Komplexen der Klasse B steuert – insbesondere durch die Partnerschaft mit dem Calcitonin-Rezeptor-ähnlichen Rezeptor (CALCRL) zur Bildung des kanonischen CGRP-Rezeptors. Indem RAMP1 die Rezeptorreifung und die Lokalisation an der Zelloberfläche prägt, beeinflusst es die CGRP-vermittelte cAMP/PKA-Signalübertragung sowie nachgeschaltete Transkriptionsprogramme, die den neurovaskulären Tonus und entzündliche Neuropeptidantworten regulieren. RAMP1-abhängige Signalwege werden breit mit Mechanismen in Verbindung gebracht, die der Migränebiologie sowie allgemeineren neurovaskulären und schmerzbezogenen Prozessen zugrunde liegen; zudem wird RAMP1 in der kardiovaskulären Regulation und der Physiologie der Atemwege untersucht. Daher ist die Modulation der RAMP1-Expression hilfreich, um die Funktion von GPCR-Zubehörproteinen, die Rezeptorpharmakologie und kontextspezifische Signalisierungsverzerrungen (Signaling Bias) in relevanten humanen Zellmodellen zu untersuchen.

RAMP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAMP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RAMP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAMP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAMP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RAMP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAMP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RAMP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RAMP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAMP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.