Plasmide CRISPR d'Activation (m) Rac 1: sc-422573-ACT

Rac1 code Rac 1, une petite GTPase de la famille Rho qui alterne entre les états liés au GDP et au GTP afin de coordonner le remodelage du cytosquelette d’actine, la formation de lamellipodes et la polarité cellulaire. Dans les cellules de souris, RAC1 intègre des signaux provenant des récepteurs à activité tyrosine kinase, des intégrines et des récepteurs de chimiokines pour réguler des voies impliquant PAK, PI3K/AKT, MAPK ainsi que la nucléation de l’actine dépendante de WAVE/ARP2/3. Ces processus influencent la dynamique d’adhésion, le trafic vésiculaire et la signalisation des espèces réactives de l’oxygène via les complexes NADPH oxydase. Une activité dérégulée de RAC1 a été associée à des phénotypes de migration et d’invasion altérés, à une signalisation développementale aberrante et à la biologie tumorale, ce qui en fait un nœud clé dans les études mécanistiques du contrôle du cytosquelette et de la transduction du signal.

Rac 1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Rac1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rac 1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Rac1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Rac1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rac 1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Rac1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rac 1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rac 1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Rac1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.