Plasmide CRISPR d'Activation (m) Rab 7: sc-422571-ACT

Rab7 code Rab7, une petite GTPase qui régule la maturation des endosomes tardifs, le trafic endosome–lysosome et le positionnement des lysosomes grâce au recrutement coordonné d’effecteurs contrôlant la motilité des vésicules et la fusion membranaire. Dans les cellules de souris, Rab7 joue un rôle central dans le flux autophagique en favorisant la fusion autophagosome–lysosome et en soutenant la dégradation des cargaisons endocytées, modulant ainsi le renouvellement des récepteurs et les voies de détection des nutriments. La perturbation du trafic dépendant de Rab7 dérègle l’homéostasie lysosomale et peut influencer la présentation d’antigènes, le contrôle qualité mitochondrial et la signalisation neuro-immune. Une activité altérée de Rab7 a été associée à des mécanismes pathologiques impliquant la neurodégénérescence, les neuropathies périphériques et la biologie des infections, via des défauts de trafic intracellulaire et des voies de dégradation.

Rab 7 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Rab7 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 7 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Rab7 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Rab7, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 7. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Rab7 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 7 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 7 dans les cellules tumorales présentant une expression de Rab7 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.