Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab 6: sc-417258-ACT

RAB6A code la petite GTPase Rab6, un régulateur central du trafic membranaire au sein de l’appareil de Golgi et le long des voies de transport rétrograde vers le réticulum endoplasmique. En alternant entre des états liés au GTP et au GDP, Rab6 coordonne l’amarrage des vésicules, le tri des cargos et le transport dépendant des microtubules, via des interactions avec des effecteurs impliqués dans le maintien du Golgi et la dynamique de la voie sécrétoire. L’activité de RAB6A influence l’organisation des organites, la sécrétion protéique et le trafic endosomal, des processus fréquemment remodelés dans le cancer et les maladies neurodégénératives. Des altérations du transport dépendant de Rab6 ont également été associées à l’exploitation du trafic cellulaire par des agents pathogènes ainsi qu’à des réponses au stress cellulaire affectant la protéostasie.

Rab 6A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB6A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 6A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB6A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB6A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 6A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB6A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 6A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 6A dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB6A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.