Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab 44: sc-418677-ACT

RAB44 code Rab44, une petite GTPase de la famille Rab de grande taille, impliquée dans le trafic vésiculaire et la dynamique membranaire qui coordonnent le transport intracellulaire, l’organisation endolysosomale et la sécrétion régulée. En tant qu’interrupteur moléculaire alternant entre des états liés au GTP et au GDP, Rab44 devrait interagir avec les machineries d’arrimage et de fusion dépendantes des Rab, qui façonnent la maturation des compartiments et les sorties de signalisation. Des profils d’expression altérés de RAB44 ont été rapportés dans des contextes liés à l’immunité et dans des transcriptomes de cancers, ce qui étaye son utilisation comme marqueur et comme nœud fonctionnel pour étudier des programmes de trafic dérégulés dans des états cellulaires associés aux maladies. L’étude de l’activité de Rab44 peut aider à préciser comment le transport vésiculaire influence le recyclage des récepteurs, la signalisation inflammatoire et les réponses au stress cellulaire.

Rab 44 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB44 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 44 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB44 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB44, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 44. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB44 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 44 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 44 dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB44 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.