Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab 1A: sc-401515-ACT

RAB1A code la petite GTPase Rab1A, un régulateur central du trafic du réticulum endoplasmique (RE) vers l’appareil de Golgi, qui coordonne l’arrimage, l’amarrage et la fusion des vésicules COPII afin de maintenir le flux de la voie sécrétoire et l’homéostasie des organites. En contrôlant la dynamique du transport membranaire, Rab1A influence l’organisation du Golgi, la maturation des glycoprotéines, les événements de trafic liés à l’autophagie et, plus largement, les réseaux de protéostasie. Une perturbation du transport médié par RAB1A a été associée aux réponses cellulaires au stress et à une dérégulation des signaux de croissance, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des défauts de transport vésiculaire, des déséquilibres de protéostasie et du remaniement des voies de signalisation dans des modèles de maladies. En tant que nœud conservé de la logistique intracellulaire, Rab1A est fréquemment étudiée dans des approches de génomique fonctionnelle reliant des phénotypes de trafic à des sorties de signalisation et métaboliques.

Rab 1A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 1A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 1A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 1A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 1A dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.