Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab 14: sc-402109-ACT

RAB14 code Rab14, une petite GTPase de la superfamille RAS qui coordonne le trafic membranaire en alternant entre les états liés au GDP et au GTP afin de contrôler le bourgeonnement, le transport et la fusion des vésicules. Rab14 régule le recyclage endocytaire et le transport biosynthétique entre le réseau trans-Golgi, les endosomes précoces/de recyclage et la membrane plasmique, influençant le tri des cargos, le renouvellement des récepteurs et le trafic polarisé. Par ces processus, RAB14 contribue au maintien de la polarité cellulaire, à la distribution des transporteurs de nutriments et à la dynamique de la transduction du signal. Dans la littérature, des altérations du trafic régulé par Rab14 ont été associées à des programmes de prolifération et de migration dérégulés observés dans de multiples contextes pathologiques, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques de phénotypes dépendants du transport vésiculaire.

Rab 14 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB14 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 14 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB14 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB14, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 14. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB14 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 14 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 14 dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB14 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.