Plasmide CRISPR d'Activation (m) PYK2: sc-422493-ACT

La protéine murine Ptk2b code PYK2, une tyrosine kinase non réceptrice activée par les flux de Ca²⁺ et l’engagement des intégrines, qui coordonne la signalisation au niveau des adhérences focales et des interfaces avec le cytosquelette. PYK2 intègre des signaux issus des GPCR, des récepteurs de facteurs de croissance et des récepteurs immunitaires afin de moduler l’adhérence, la migration et la survie cellulaires, et elle s’articule avec des voies incluant les kinases de la famille Src, MAPK/ERK, PI3K-AKT et la signalisation des GTPases Rho. Dans les contextes hématopoïétiques et myéloïdes, Ptk2b influence la signalisation inflammatoire et la motilité des phagocytes, tandis que dans les cellules neuronales elle contribue à des programmes de signalisation synaptique et dépendants de l’activité. Une activité dérégulée de PYK2 et des associations génétiques de PTK2B ont été reliées dans la littérature à des processus impliqués dans l’immunité et pertinents pour la neurodégénérescence, ce qui étaye des études mécanistiques des réseaux de signalisation et des phénotypes cellulaires.

PYK2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ptk2b sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PYK2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ptk2b dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ptk2b, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PYK2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ptk2b natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PYK2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PYK2 dans les cellules tumorales présentant une expression de Ptk2b silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.