Plasmide CRISPR d'Activation (h) PTPκ: sc-402287-ACT

PTPRK code la protéine tyrosine phosphatase récepteur de type K (PTPκ), une phosphatase de type récepteur qui module la signalisation dépendante de la phosphorylation au niveau de la membrane plasmique et des jonctions cellule–cellule. En déphosphorylant des substrats impliqués dans l’adhésion et la signalisation des facteurs de croissance, PTPκ contribue à la régulation de l’intégrité épithéliale, de l’inhibition de contact et de l’organisation du cytosquelette. L’activité de PTPRK recoupe des voies liées à la dynamique des jonctions d’adhérence et aux sorties des récepteurs à activité tyrosine kinase, influençant les programmes de prolifération et de migration. Une expression ou une fonction altérée de PTPRK a été associée à des réseaux de signalisation dérégulés observés dans plusieurs contextes pathologiques, ce qui soutient son intérêt comme cible mécanistique dans les études de signalisation cellulaire et de biologie des jonctions.

PTPκ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PTPRK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PTPκ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PTPRK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PTPRK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PTPκ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PTPRK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PTPκ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PTPκ dans les cellules tumorales présentant une expression de PTPRK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.