Plasmide CRISPR d'Activation (m) PSS2: sc-424258-ACT

La protéine Ptdss2 de souris code la phosphatidylsérine synthase 2 (PSS2), une enzyme membranaire du réticulum endoplasmique qui catalyse la production de phosphatidylsérine (PS) par réaction d’échange de base à partir de la phosphatidyléthanolamine. En contrôlant les réserves cellulaires de PS, PSS2 contribue à la biogenèse des membranes, à l’homéostasie lipidique et au fonctionnement des organites, avec des répercussions sur des processus tels que le trafic vésiculaire, la physiologie mitochondriale et la signalisation liée à l’apoptose, pour lesquels la distribution de la PS est déterminante. Une perturbation de la biosynthèse de la PS peut modifier la composition membranaire et les réseaux de signalisation associés à l’adaptation métabolique et aux réponses au stress, ce qui fait de la régulation de Ptdss2 un élément pertinent pour des études mécanistiques de phénotypes cellulaires dépendants des lipides. En tant que nœud central du métabolisme des glycérophospholipides, PSS2 constitue un point d’entrée accessible pour explorer comment la composition lipidique des membranes influence l’état cellulaire et des voies associées aux maladies.

PSS2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ptdss2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PSS2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ptdss2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ptdss2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PSS2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ptdss2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PSS2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PSS2 dans les cellules tumorales présentant une expression de Ptdss2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.