Plasmide CRISPR d'Activation (h) PRK2: sc-407649-ACT

PKN2 code la protéine kinase N2 (PRK2), une kinase sérine/thréonine de la famille AGC qui agit comme effecteur de la signalisation des petites GTPases de la famille Rho afin de coordonner la dynamique du cytosquelette, le renouvellement des adhésions focales et la motilité cellulaire. L’activité de PRK2 intègre des signaux issus des voies liées aux GPCR et aux facteurs de croissance pour influencer le remodelage de l’actine, la formation de fibres de stress et le trafic vésiculaire, avec des effets en aval sur les programmes de prolifération et de survie. Par ces fonctions, PRK2 a été impliquée dans des processus pertinents pour l’invasion des cellules tumorales et le comportement métastatique, ainsi que dans une dérégulation plus large de la migration et de la signalisation dépendante de l’adhésion observée dans divers contextes pathologiques. Moduler l’expression endogène de PKN2 est donc utile pour disséquer la connectivité des voies entre la signalisation associée à Rho/ROCK, l’organisation du cytosquelette et les sorties transcriptionnelles.

PRK2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PKN2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PRK2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PKN2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PKN2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PRK2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PKN2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PRK2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PRK2 dans les cellules tumorales présentant une expression de PKN2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.