Plasmide CRISPR d'Activation (h) PRAME: sc-404682-ACT

PRAME (preferentially expressed antigen in melanoma) code un antigène cancer‑testis qui agit principalement comme régulateur transcriptionnel, surtout connu pour réprimer la signalisation du récepteur de l’acide rétinoïque et atténuer les programmes de différenciation induits par les rétinoïdes. En modulant la transcription dépendante des récepteurs nucléaires et le contrôle épigénétique associé, PRAME peut influencer la progression du cycle cellulaire, l’engagement de lignée et l’expression de gènes liés à l’apoptose. Une expression aberrante de PRAME est rapportée dans de multiples contextes tumoraux et PRAME est fréquemment utilisé comme marqueur moléculaire dans des études portant sur l’état oncogénique, la reconnaissance immunitaire et la plasticité des cellules tumorales. Dans des modèles cellulaires humains, la perturbation de PRAME permet d’étudier comment des réseaux transcriptionnels altérés et des signaux de différenciation contribuent aux phénotypes malins et aux profils d’expression des antigènes.

PRAME Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRAME sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PRAME Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRAME dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRAME, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PRAME. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRAME natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PRAME au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PRAME dans les cellules tumorales présentant une expression de PRAME silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.