Plasmide CRISPR d'Activation (h) PPOX: sc-410546-ACT

La PPOX (protoporphyrinogène oxydase) humaine est une enzyme de la membrane interne mitochondriale qui catalyse l’oxydation du protoporphyrinogène IX en protoporphyrine IX, une étape tardive clé de la biosynthèse de l’hème. En contrôlant le flux des porphyrines, la PPOX soutient la production d’hémoprotéines et l’équilibre rédox cellulaire, reliant le métabolisme mitochondrial à la gestion de l’oxygène et aux réponses au stress oxydatif. Une altération ou une dérégulation de l’activité de la PPOX perturbe l’homéostasie des porphyrines et est associée à des phénotypes de porphyrie caractérisés par une accumulation anormale de porphyrines. La PPOX est donc largement étudiée dans les voies impliquées dans le métabolisme de l’hème et des porphyrines, la fonction mitochondriale et la signalisation du stress métabolique.

PPOX Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPOX sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PPOX Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPOX dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPOX, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PPOX. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPOX natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PPOX au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PPOX dans les cellules tumorales présentant une expression de PPOX silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.