PON2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403181-ACT

Humanes PON2 (Paraoxonase 2) ist eine ubiquitär exprimierte, membranassoziierte Laktonase mit antioxidativer Aktivität, die die Lipidperoxidation begrenzt und dazu beiträgt, die Membranintegrität unter oxidativem Stress zu erhalten. PON2 moduliert die Redoxhomöostase und die mitochondriale Funktion, indem es die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies abschwächt und stressantwortliche Signalwege beeinflusst, einschließlich solcher, die mit Entzündung und metabolischer Regulation verknüpft sind. Eine veränderte Expression und Aktivität von PON2 wurde mit Prozessen in Verbindung gebracht, die für Atherosklerose, Insulinresistenz und das Überleben von Tumorzellen relevant sind, wobei Verschiebungen im oxidativen Gleichgewicht die zelluläre Fitness und Signalausgaben neu gestalten können. Daher wird PON2 häufig in Modellen der Endotheldysfunktion, der Makrophagenbiologie, des mitochondrialen Stresses und oxidativschadensgetriebener Phänotypen untersucht.

PON2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PON2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PON2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PON2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PON2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PON2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PON2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PON2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PON2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PON2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.