Pol III RPC32 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-417072-LAC

POLR3G codifica RPC32 di Pol III, una subunità essenziale dell’RNA polimerasi III che sostiene la trascrizione di piccoli RNA non codificanti, inclusi tRNA, rRNA 5S e altri RNA regolatori indispensabili per la capacità di traduzione, la crescita cellulare e la proteostasi. RPC32 contribuisce all’assemblaggio del complesso Pol III e all’inizio della trascrizione dipendente dal promotore, integrandosi con vie che collegano il sensing dei nutrienti e i segnali proliferativi all’output biosintetico. Un’attività alterata di Pol III e una produzione deregolata di piccoli RNA sono spesso studiate nel contesto della trasformazione oncogenica, delle risposte allo stress cellulare e della segnalazione immunitaria innata innescata da specie di RNA citosoliche. POLR3G rappresenta quindi un punto di accesso meccanicistico per indagare il controllo trascrizionale della biogenesi degli RNA non codificanti e il suo impatto sulle decisioni di stato cellulare.

Le particelle di attivazione lentivirale Pol III RPC32 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di POLR3G in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Pol III RPC32 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione POLR3G, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Pol III RPC32. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo POLR3G e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.