Plasmide CRISPR d'Activation (m) podoplanin: sc-420632-ACT

Le gène murin *Pdpn* code la podoplanine, une glycoprotéine transmembranaire de type mucine exprimée dans les cellules endothéliales lymphatiques, les cellules réticulaires fibroblastiques et certains compartiments épithéliaux, où elle régule la forme cellulaire, l’adhérence et la motilité directionnelle. La podoplanine se lie au récepteur plaquettaire CLEC-2, influençant le remodelage du cytosquelette via la signalisation RhoA/ROCK, et coordonne la dynamique de l’actine, essentielle à la lymphangiogenèse, à l’organisation tissulaire et à la formation de réseaux stromaux. Dans le microenvironnement tumoral, des cellules stromales et tumorales PDPN-positives ont été associées à un comportement invasif, au remodelage de la matrice extracellulaire et à une modification du trafic des cellules immunitaires. Une expression dérégulée de PDPN est également liée au remodelage inflammatoire et à des voies pertinentes pour la fibrose, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques de la biologie vasculaire et stromale.

podoplanin Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Pdpn sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

podoplanin Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Pdpn dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Pdpn, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de podoplanin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Pdpn natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de podoplanin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie podoplanin dans les cellules tumorales présentant une expression de Pdpn silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.