PNPase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404406-ACT

PNPT1 kodiert die Polyribonukleotid‑Nukleotidyltransferase 1 (PNPase), eine konservierte 3′–5′‑Exoribonuklease und ein Poly(A)‑Polymerase‑ähnliches Enzym, das überwiegend in den Mitochondrien lokalisiert ist und den RNA‑Umsatz sowie die RNA‑Überwachung reguliert. PNPase ist an der mitochondrialen RNA‑Prozessierung, der Aufrechterhaltung der mitochondrialen Genexpression und der Kontrolle der zytosolischen und mitochondrialen RNA‑Homöostase beteiligt und beeinflusst dadurch die oxidative Phosphorylierung und den zellulären Energiestoffwechsel. Störungen der PNPT1‑Funktion werden mit Phänotypen einer mitochondrialen Dysfunktion in Verbindung gebracht und im Kontext neuroentwicklungsbedingter und neuromuskulärer Erkrankungen untersucht, ebenso wie in übergeordneten Signalwegen, die mitochondriale Stressantworten und eine durch aberrante RNA‑Spezies ausgelöste Aktivierung der angeborenen Immunantwort umfassen.

PNPase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PNPT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PNPase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PNPT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PNPT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PNPase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PNPT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PNPase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PNPase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PNPT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.