Plasmide CRISPR d'Activation (h) PMS2: sc-401600-ACT

PMS2 code un composant central de la machinerie de réparation des mésappariements de l’ADN (MMR) qui forme l’hétérodimère MutLα avec MLH1 afin de détecter et de corriger les mésappariements base–base ainsi que les boucles d’insertion/délétion survenant lors de la réplication de l’ADN. Grâce à une coordination dépendante de l’ATP de l’activité endonucléase, de l’excision et de la resynthèse, PMS2 contribue à préserver la stabilité du génome et à limiter la charge mutationnelle au sein des populations cellulaires en prolifération. Une perturbation ou une diminution de l’activité de PMS2 est associée à des phénotypes d’instabilité des microsatellites et est fréquemment étudiée dans le contexte des syndromes héréditaires de prédisposition au cancer et de l’évolution tumorale induite par une réparation défectueuse de l’ADN. Par conséquent, PMS2 est largement utilisé pour étudier la fidélité de la réplication, les interactions avec la réponse aux dommages de l’ADN et les mécanismes qui façonnent les spectres de mutations.

PMS2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PMS2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PMS2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PMS2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PMS2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PMS2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PMS2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PMS2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PMS2 dans les cellules tumorales présentant une expression de PMS2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.