Plásmido CRISPR de Activación (h) PMCA2: sc-403416-ACT

ATP2B2 codifica la isoforma PMCA2 de la ATPasa de Ca2+ de la membrana plasmática, una bomba de extrusión de Ca2+ de alta afinidad que mantiene bajo el calcio citosólico y moldea los transitorios de Ca2+ dependientes del estímulo. Al acoplar la hidrólisis de ATP al eflujo de Ca2+, PMCA2 sustenta redes de señalización dependientes de calcio que regulan la excitabilidad neuronal, la transmisión sináptica y los procesos de transporte epitelial. La actividad de PMCA2 se entrecruza con vías reguladas por calmodulina, la señalización en microdominios de membrana y la retroalimentación homeostática que evita el estrés proteotóxico y mitocondrial impulsado por Ca2+. Las alteraciones en la expresión o la función de ATP2B2/PMCA2 se han asociado con un manejo del calcio desregulado, implicado en fenotipos neurológicos y disfunción del sistema sensorial, lo que respalda su relevancia para estudios mecanísticos de la señalización de Ca2+.

PMCA2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ATP2B2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PMCA2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ATP2B2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ATP2B2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PMCA2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ATP2B2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PMCA2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PMCA2 en células tumorales con expresión de ATP2B2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.