Plasmide CRISPR d'Activation (h) PLUNC: sc-416774-ACT

BPIFA1 code pour PLUNC (« palate, lung, and nasal epithelium clone »), une protéine d’immunité innée sécrétée, enrichie dans l’épithélium des voies aériennes supérieures et le liquide de surface des voies aériennes. PLUNC contribue à la défense de l’hôte au niveau des muqueuses en modulant l’activité antimicrobienne, en influençant la formation de biofilms et en régulant la tension superficielle des voies aériennes ainsi que l’homéostasie de la barrière épithéliale. L’expression de BPIFA1 est liée aux programmes de différenciation épithéliale et à la signalisation inflammatoire dans les voies respiratoires, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de l’inflammation chronique des voies aériennes et de la biologie des infections. Des taux modifiés de PLUNC ont été associés à des maladies des voies aériennes caractérisées par une immunité muqueuse dérégulée, notamment l’asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) et la rhinosinusite chronique.

PLUNC Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BPIFA1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PLUNC Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BPIFA1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BPIFA1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PLUNC. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BPIFA1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PLUNC au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PLUNC dans les cellules tumorales présentant une expression de BPIFA1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.