Plasmide CRISPR d'Activation (h) PLC β1: sc-401141-ACT

Le gène humain **PLCB1** code la phospholipase C β1 (PLCβ1), un effecteur clé en aval des récepteurs couplés aux protéines G, qui relie la signalisation Gαq/11 au renouvellement des phosphoinositides. Lorsqu’elle est activée, la PLCβ1 hydrolyse le PIP2 pour produire l’IP3 et le diacylglycérol, déclenchant la libération intracellulaire de Ca2+ et l’activation de la PKC, lesquelles influencent la sécrétion, l’excitabilité et les programmes transcriptionnels. Cet axe de signalisation s’intègre aux voies MAPK et aux voies dépendantes du calcium pour façonner les réponses des neurones et des cellules immunitaires, et une activité altérée de PLCB1 a été associée à des phénotypes neuropsychiatriques et neurologiques ainsi qu’à une dérégulation de la signalisation cellulaire dans des contextes pertinents pour la maladie. L’étude de la régulation de PLCB1 aide à préciser comment les dynamiques des seconds messagers induites par les récepteurs contrôlent l’expression génique en aval et l’état cellulaire.

PLC β1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PLCB1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PLC β1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PLCB1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PLCB1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PLC β1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PLCB1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PLC β1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PLC β1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PLCB1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.