PKC delta CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400287-ACT

PRKCD kodiert die Proteinkinase C Delta (PKCδ), eine diacylglycerol-responsive Serin/Threonin-Kinase, die rezeptorvermittelte Signale mit nachgeschalteten Phosphorylierungsprogrammen koppelt, welche Proliferation, Differenzierung, Apoptose und Zytoskelett-Umbau steuern. PKCδ ist an der PKC/MAPK- und PI3K–AKT-Kreuzregulation beteiligt, moduliert NF-κB-abhängige inflammatorische Signalübertragung und reguliert DNA-Schadensantworten über die Phosphorylierung von Stress- und Checkpoint-Effektoren. In Immun- und hämatopoetischen Zellen trägt PRKCD zur Feinabstimmung der B‑Zell-Rezeptor-Signalgebung und der Toleranz bei, während es in epithelialen Kontexten Adhäsion und Migrationsverhalten beeinflusst. Eine fehlregulierte PRKCD-Aktivität oder -Expression wurde mit veränderten Apoptoseschwellen, inflammatorischen Phänotypen und einer Umverdrahtung onkogener Signalwege in Verbindung gebracht, wodurch es ein relevanter Knotenpunkt für pfadzentrierte mechanistische Studien ist.

PKC delta Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRKCD-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PKC delta Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRKCD-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRKCD-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PKC delta-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRKCD-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PKC delta-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PKC delta-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRKCD-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.