Plasmide CRISPR d'Activation (h) PGI2 synthase: sc-403180-ACT

Le gène humain **PTGIS** code la prostacycline (PGI2) synthase, une enzyme du cytochrome P450 qui convertit la prostaglandine H2 en prostacycline, un médiateur lipidique qui augmente la signalisation via l’AMPc et module la fonction plaquettaire, le tonus vasculaire et les réponses inflammatoires. PTGIS intervient dans les voies de biosynthèse de l’acide arachidonique et des eicosanoïdes, en s’intégrant à la production de prostanoïdes dérivés de la COX pour façonner les phénotypes des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses. Des altérations de l’expression de PTGIS ou de l’équilibre en PGI2 ont été associées à la biologie cardiovasculaire et inflammatoire, notamment au remodelage vasculaire et à des processus liés à la thrombose, et sont également pertinentes pour la signalisation du microenvironnement tumoral via les réseaux de prostanoïdes. Ainsi, PTGIS constitue une cible utile pour analyser la régulation dépendante des prostanoïdes de l’activation endothéliale, du trafic des cellules immunitaires et des réponses au stress oxydatif dans des modèles cellulaires humains.

PGI2 synthase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PTGIS sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PGI2 synthase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PTGIS dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PTGIS, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PGI2 synthase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PTGIS natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PGI2 synthase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PGI2 synthase dans les cellules tumorales présentant une expression de PTGIS silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.