Plasmide CRISPR d'Activation (h) Perforin 1: sc-400976-ACT

PRF1 code la perforine 1, un effecteur cytolytique formant des pores, indispensable à la mise à mort médiée par les granules des lymphocytes T cytotoxiques et des cellules NK. Lors de la formation de la synapse immunologique, la perforine facilite l’entrée des granzymes dans les cellules cibles afin de déclencher des programmes apoptotiques, en s’intégrant aux voies qui contrôlent la surveillance immunitaire, la défense antivirale et l’immuno-édition tumorale. L’activité de PRF1 est étroitement liée à l’état d’activation des lymphocytes et à la dynamique de dégranulation, et une expression ou une fonction altérée est associée à des phénotypes de dérégulation immunitaire, notamment une cytotoxicité diminuée et des syndromes hyperinflammatoires. En tant que composant central de la cytotoxicité à médiation cellulaire, PRF1 est largement étudié dans des contextes tels que la biologie des infections, l’échappement immunitaire et les lésions tissulaires inflammatoires.

Perforin 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRF1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Perforin 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRF1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRF1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Perforin 1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRF1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Perforin 1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Perforin 1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PRF1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.