Plasmide CRISPR d'Activation (h) PEPT2: sc-404322-ACT

SLC15A2 code PEPT2, un transporteur d’oligopeptides à haute affinité couplé aux protons appartenant à la famille des transporteurs de solutés (SLC), qui assure l’absorption et la réabsorption des di- et tripeptides ainsi que de métabolites de type peptidique. PEPT2 contribue à la détection cellulaire des nutriments et au maintien de l’homéostasie des acides aminés en reliant les gradients transmembranaires de H+ au transport des peptides, avec des rôles importants dans les processus de transport épithélial et le métabolisme associé aux barrières. Par sa prise en charge de substrats peptidiques et de composés peptidomimétiques, PEPT2 est pertinent pour la recherche en pharmacocinétique et en toxicologie, en particulier dans les tissus où l’expression du transporteur peut moduler les profils d’exposition intracellulaire. Des altérations de l’activité de SLC15A2 ont été étudiées dans des contextes de dysfonction rénale et épithéliale, ainsi que dans des travaux sur la susceptibilité au stress xénobiotique médiée par les transporteurs.

PEPT2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC15A2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PEPT2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC15A2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC15A2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PEPT2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC15A2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PEPT2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PEPT2 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC15A2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.