Plasmide CRISPR d'Activation (h) PEPCK-C/PCK1: sc-401295-ACT

Le gène humain **PCK1** code la phosphoénolpyruvate carboxykinase cytosolique (PEPCK-C), une enzyme limitante de la néoglucogenèse qui catalyse la conversion de l’oxaloacétate en phosphoénolpyruvate en utilisant le GTP. PEPCK-C coordonne la production hépatique et rénale de glucose avec le métabolisme central du carbone, en reliant des intermédiaires du cycle de l’acide citrique (cycle de Krebs) aux flux glycolytiques et anaplérotiques. Son expression est étroitement régulée par des signaux hormonaux et nutritionnels via des réseaux transcriptionnels impliquant la signalisation AMPc/PKA, les voies de réponse aux glucocorticoïdes et une répression dépendante de l’insuline. Les dérégulations de l’activité de PCK1 et de son contrôle transcriptionnel sont largement étudiées dans le contexte des maladies métaboliques, notamment la résistance à l’insuline, la stéatose hépatique et le remodelage métabolique tumoral.

PEPCK-C/PCK1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PCK1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PEPCK-C/PCK1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PCK1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PCK1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PEPCK-C/PCK1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PCK1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PEPCK-C/PCK1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PEPCK-C/PCK1 dans les cellules tumorales présentant une expression de PCK1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.