Plasmide CRISPR d'Activation (m) PDK4: sc-424220-ACT

Le gène murin *Pdk4* code la pyruvate déshydrogénase kinase 4 (PDK4), une enzyme mitochondriale qui phosphoryle et inhibe le complexe pyruvate déshydrogénase afin de réduire l’entrée du pyruvate dans le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA/Krebs) et de réorienter le flux de carbone vers l’oxydation des acides gras. En modulant l’alternance d’utilisation des substrats glucose/lipides, PDK4 relie la détection des nutriments aux programmes métaboliques en aval de la signalisation de l’insuline, des réponses au jeûne et de la transcription régulée par les PPAR. Des altérations de l’activité de *Pdk4*/PDK4 sont fréquemment étudiées dans des contextes d’inflexibilité métabolique, de résistance à l’insuline, de stéatose hépatique et de remodelage énergétique cardiaque, où la sélection des carburants mitochondriaux et la capacité oxydative sont perturbées. Dans des modèles murins, *Pdk4* est également utilisé pour explorer le dialogue entre le métabolisme du muscle squelettique, la lipolyse du tissu adipeux et l’homéostasie glycémique systémique.

PDK4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Pdk4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PDK4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Pdk4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Pdk4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PDK4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Pdk4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PDK4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PDK4 dans les cellules tumorales présentant une expression de Pdk4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.