Plasmide CRISPR d'Activation (m) PDE4B: sc-422161-ACT

Le gène murin **Pde4b** code la phosphodiestérase 4B (PDE4B), une phosphodiestérase spécifique de l’AMPc qui hydrolyse l’AMPc en 5′-AMP et limite les voies de signalisation compartimentées PKA/CREB et EPAC. En façonnant les gradients intracellulaires d’AMPc, PDE4B influence les réponses induites par les GPCR, les programmes transcriptionnels régulés par les cytokines et l’activité en aval des voies MAPK et NF-κB, de manière dépendante du type cellulaire et du contexte. La fonction de **Pde4b** est largement étudiée dans la signalisation immunitaire et inflammatoire, la plasticité neuronale et la régulation métabolique, où des altérations du renouvellement de l’AMPc peuvent modifier l’expression génique et les états d’activation cellulaire. Une signalisation dérégulée associée à PDE4B a été reliée à des phénotypes pertinents pour l’inflammation et la neurobiologie comportementale, ce qui étaye son utilisation dans des études mécanistiques de modulation des voies.

PDE4B Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Pde4b sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PDE4B Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Pde4b dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Pde4b, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PDE4B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Pde4b natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PDE4B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PDE4B dans les cellules tumorales présentant une expression de Pde4b silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.