Plasmide CRISPR d'Activation (h) PDC-E2: sc-402520-ACT

Le gène humain **DLAT** code la **PDC‑E2** (dihydrolipoamide acétyltransférase), la sous-unité centrale **E2** du complexe mitochondrial **pyruvate déshydrogénase**, qui oriente le pyruvate issu de la glycolyse vers le cycle de l’acide citrique (cycle de Krebs) en générant de l’**acétyl‑CoA**. Cette enzyme dépendante du lipoate soutient le flux carboné central, l’équilibre rédox et le métabolisme énergétique mitochondrial, et couple fonctionnellement l’oxydation du pyruvate à la capacité respiratoire. L’activité de **DLAT/PDC‑E2** recoupe la détection des nutriments et les réponses au stress oxydant via son impact sur la production de **NADH** et, en aval, sur la chaîne de transport d’électrons. La dérégulation des composants du complexe pyruvate déshydrogénase est associée au remodelage métabolique observé dans des contextes de cancer et de neurodégénérescence, et la PDC‑E2 est également pertinente pour les études de la biologie des autoantigènes mitochondriaux.

PDC-E2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DLAT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PDC-E2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DLAT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DLAT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PDC-E2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DLAT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PDC-E2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PDC-E2 dans les cellules tumorales présentant une expression de DLAT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.