PCCA CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404791-ACT

PCCA kodiert die Alpha‑Untereinheit der Propionyl‑CoA‑Carboxylase, eines biotinabhängigen mitochondrialen Enzyms, das die ATP‑abhängige Umwandlung von Propionyl‑CoA zu D‑Methylmalonyl‑CoA katalysiert. Diese Reaktion ist essenziell für den Abbau verzweigtkettiger Aminosäuren, ungeradkettiger Fettsäuren und von Cholesterin‑Seitenketten und verknüpft damit die Nutzung von Aminosäuren und Lipiden mit der mitochondrialen Anaplerose und dem Energiestoffwechsel. Die PCCA‑Funktion steht in Wechselwirkung mit dem Biotinstoffwechsel, der Homöostase mitochondrialer Proteine und metabolischen Stressantworten, die das Redoxgleichgewicht und den Umgang mit organischen Säuren beeinflussen. Eine pathogene Beeinträchtigung der PCCA‑Aktivität ist mit der Propionazidämie assoziiert, wodurch PCCA ein nützliches Ziel für die Untersuchung metabolischer Dysfunktionen, mitochondrialer Stresssignalwege und von Genotyp‑Phänotyp‑Beziehungen in menschlichen Zellmodellen darstellt.

PCCA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PCCA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PCCA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PCCA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PCCA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PCCA-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PCCA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PCCA-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PCCA-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PCCA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.