Plasmide CRISPR d'Activation (m) PBGD: sc-420870-ACT

Le gène murin **Hmbs** code la porphobilinogène désaminase (PBGD), une enzyme cytosolique qui catalyse la polymérisation de quatre molécules de porphobilinogène pour former l’hydroxyméthylbilane, un intermédiaire central de la voie de biosynthèse de l’hème. En soutenant la disponibilité en hème, la PBGD influence la respiration mitochondriale, la fonction des cytochromes et l’homéostasie redox, avec des effets en aval sur la maturation érythroïde et le métabolisme oxydatif cellulaire. Une perturbation de l’activité de HMBS/PBGD est associée à une dérégulation du métabolisme des porphyrines et à l’accumulation d’intermédiaires en amont, faisant de ce gène un nœud clé pour modéliser les réponses au stress métabolique. **Hmbs** est donc pertinent pour des études portant sur la physiologie hépatique et hématopoïétique, la bioénergétique mitochondriale et la régulation, à l’échelle des voies, de la synthèse des tétrapyrroles.

PBGD Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Hmbs sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PBGD Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Hmbs dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Hmbs, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PBGD. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Hmbs natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PBGD au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PBGD dans les cellules tumorales présentant une expression de Hmbs silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.