Plasmide CRISPR d'Activation (h) Pax-3: sc-401657-ACT

PAX3 code le facteur de transcription à boîte appariée Pax-3, un régulateur majeur de la mise en place des patrons embryonnaires qui coordonne la spécification des cellules de la crête neurale, la myogenèse et l’engagement de la lignée mélanocytaire. Pax-3 contrôle des programmes d’expression génique qui gouvernent le maintien des progéniteurs, leur migration et leur différenciation, en s’intégrant à des réseaux de signalisation du développement, notamment les voies WNT, BMP et FGF. En biologie humaine, une régulation altérée de PAX3 est associée à des phénotypes de pigmentation et de développement cranio-facial et est fréquemment étudiée dans des contextes de plasticité de lignée. Une activité dérégulée de PAX3 est également pertinente pour les circuits transcriptionnels oncogéniques, notamment via des mécanismes entraînés par des fusions et des états aberrants de type « stem-like » dans des modèles de recherche sur les sarcomes et les mélanomes.

Pax-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PAX3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Pax-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PAX3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PAX3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Pax-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PAX3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Pax-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Pax-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de PAX3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.