Plasmide CRISPR d'Activation (h) PARL: sc-403965-ACT

PARL (presenilin associated rhomboid like) code une protéase sérine rhomboïde de la membrane interne mitochondriale qui régule le contrôle qualité mitochondrial en clivant des substrats impliqués dans la mitophagie, le remodelage des crêtes et l’apoptose. La protéolyse dépendante de PARL influence la signalisation PINK1/Parkin via le clivage de PINK1, modulant ainsi les réponses à la dépolarisation mitochondriale et le renouvellement des organites. En façonnant la dynamique mitochondriale liée à OPA1 et la susceptibilité apoptotique associée au cytochrome c, PARL relie l’homéostasie bioénergétique aux voies de signalisation du stress. Une activité de PARL dérégulée et une protéostasie mitochondriale altérée ont été impliquées dans la neurodégénérescence, les dysfonctionnements métaboliques et le reprogrammation mitochondriale pertinente en cancérologie, ce qui en fait un nœud fonctionnel utile dans la recherche sur les voies mitochondriales.

PARL Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PARL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PARL Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PARL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PARL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PARL. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PARL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PARL au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PARL dans les cellules tumorales présentant une expression de PARL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.