Plásmido CRISPR de Activación (h) PAR-4: sc-401719-ACT

F2RL3 codifica el receptor activado por proteasas 4 (PAR-4), un receptor acoplado a proteína G que se activa por la trombina y otras proteasas de serina mediante el desenmascaramiento proteolítico de un ligando anclado. La señalización de PAR-4 activa las vías de Gq y G12/13 para estimular la actividad de la fosfolipasa C, la movilización intracelular de Ca2+, la señalización RhoA/ROCK y los programas transcripcionales posteriores de MAPK y NF-κB. En las plaquetas y en células asociadas al sistema vascular, estas cascadas regulan la activación, la secreción, la remodelación del citoesqueleto y la comunicación cruzada inflamatoria. La actividad desregulada de PAR-4 y los patrones de expresión de F2RL3 se han asociado con procesos biológicos relevantes para la trombosis, la inflamación vascular y la señalización del microambiente relacionada con el cáncer, lo que respalda estudios mecanísticos tanto en hemostasia como en las interacciones tumor–estroma.

PAR-4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de F2RL3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PAR-4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus F2RL3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional F2RL3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PAR-4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo F2RL3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PAR-4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PAR-4 en células tumorales con expresión de F2RL3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.