Plasmide CRISPR d'Activation (h) PAP-β: sc-403907-ACT

PAPOLB code la poly(A) polymérase bêta (PAP-β), une poly(A) polymérase non canonique enrichie dans les testicules, qui allonge les queues poly(A) de certains ARNm afin de soutenir la régulation génique post-transcriptionnelle. En modulant la stabilité des ARNm et l’efficacité de traduction, PAP-β contribue à des programmes de maturation des ARN essentiels à la spermatogenèse et à la différenciation des cellules germinales. Des altérations de la dynamique de polyadénylation et du métabolisme des ARN sont associées à des phénotypes d’infertilité ainsi qu’à une dérégulation plus large des réseaux d’expression génique observée dans le cancer et d’autres maladies complexes. PAPOLB constitue donc un modèle utile pour étudier la polyadénylation cytoplasmique, le remodelage du transcriptome et le contrôle des ARN spécifique de la lignée germinale.

PAP-β Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PAPOLB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PAP-β Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PAPOLB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PAPOLB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PAP-β. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PAPOLB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PAP-β au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PAP-β dans les cellules tumorales présentant une expression de PAPOLB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.