Plasmide CRISPR d'Activation (h) Pals1: sc-403059-ACT

Le gène humain **MPP5** code **Pals1** (protein associated with Lin seven 1), une protéine d’échafaudage localisée aux jonctions serrées et à la membrane apicale, où elle organise la polarité épithéliale. Pals1 agit au sein du complexe de polarité **Crumbs** et s’interface avec les assemblages **PAR** et des jonctions serrées afin de coordonner la maturation des jonctions, le trafic vésiculaire et la formation de la barrière. Par ces fonctions, MPP5 contribue à l’architecture tissulaire des épithéliums et des neuroépithéliums, et sa dérégulation est étudiée dans le contexte de la perte de polarité, de l’altération de la migration cellulaire et de l’instabilité jonctionnelle associées au dysfonctionnement épithélial et au remodelage lié à des pathologies.

Pals1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MPP5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Pals1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MPP5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MPP5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Pals1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MPP5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Pals1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Pals1 dans les cellules tumorales présentant une expression de MPP5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.