Plasmide CRISPR d'Activation (h2) PACE4: sc-405605-ACT-2

Le gène humain PCSK6 code la proprotéine convertase PACE4, une endoprotéase à sérine sécrétée et associée à la matrice extracellulaire, qui active divers précurseurs protéiques en clivant des paires de résidus basiques au sein de la voie sécrétoire et à la surface cellulaire. PACE4 contribue à la protéostasie et à la signalisation intercellulaire en maturant des facteurs de croissance, des récepteurs, des métalloprotéinases et des composants de la matrice extracellulaire, influençant ainsi des voies impliquées dans le développement, le remodelage tissulaire et la migration cellulaire. Une activité dérégulée de PCSK6/PACE4 a été associée à des réseaux protéolytiques altérés dans la progression tumorale, certains traits cardiovasculaires et des contextes de remodelage inflammatoire ou fibrotique. Les outils d’édition du gène PCSK6 et de perturbation fonctionnelle permettent des études mécanistiques de la maturation des substrats dépendante des convertases, du profilage du sécrétome et de la dissection des circuits de signalisation régulés par les protéases dans des modèles de cellules humaines.

PACE4 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PCSK6 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PACE4 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PCSK6 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PCSK6, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PACE4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PCSK6 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PACE4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PACE4 dans les cellules tumorales présentant une expression de PCSK6 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.