Plasmide CRISPR d'Activation (h) P5CR: sc-410971-ACT

Le gène humain PYCR1 code la pyrroline-5-carboxylate réductase 1 (P5CR), une enzyme mitochondriale qui catalyse la réduction de la pyrroline-5-carboxylate en proline, dépendante du NAD(P)H, lors de l’étape terminale de la biosynthèse de la proline. Par son couplage au métabolisme du glutamate et de l’ornithine, PYCR1 contribue à l’homéostasie rédox, à la disponibilité des acides aminés et à la fonction mitochondriale, avec des effets en aval sur la protéostasie et la biologie de la matrice extracellulaire. Une activité altérée de PYCR1 a été associée à des phénotypes du tissu conjonctif et à des réponses au stress métabolique, et la dérégulation du métabolisme de la proline est fréquemment étudiée dans des contextes tels que la signalisation du stress oxydatif, les microenvironnements riches en collagène et le remodelage prolifératif. Ces caractéristiques font de PYCR1 un nœud utile pour étudier comment le métabolisme mitochondrial et l’équilibre rédox façonnent l’état cellulaire et l’adaptation au stress.

P5CR Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PYCR1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

P5CR Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PYCR1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PYCR1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de P5CR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PYCR1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de P5CR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie P5CR dans les cellules tumorales présentant une expression de PYCR1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.