Plasmide CRISPR d'Activation (m) p53: sc-423509-ACT

Le gène murin Trp53 code le facteur de transcription p53, un régulateur central de l’intégrité du génome qui intègre les signaux de dommages à l’ADN, de stress oncogénique et d’état métabolique afin de coordonner l’arrêt du cycle cellulaire, la sénescence, l’apoptose et la réparation de l’ADN. L’activité de p53 s’inscrit à l’interface des voies de signalisation ATM/ATR–CHK, de la boucle de rétrocontrôle négatif via MDM2, ainsi que des voies contrôlant le stress oxydatif et l’homéostasie mitochondriale. La perturbation ou l’atténuation de la signalisation p53 est largement pertinente pour la biologie tumorale et influence les résultats expérimentaux dans les études portant sur le stress génotoxique, la régulation de la chromatine et les programmes géniques immunomodulateurs. Dans les systèmes de modèles murins, l’ajustement de l’expression de Trp53 est couramment utilisé pour explorer les mécanismes d’adaptation au stress et les phénotypes associés à la transformation.

p53 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Trp53 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

p53 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Trp53 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Trp53, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de p53. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Trp53 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de p53 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie p53 dans les cellules tumorales présentant une expression de Trp53 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.