Plasmide CRISPR d'Activation (h) p47phox: sc-417916-ACT

NCF1 code pour p47phox, une sous-unité organisatrice cytosolique du complexe NADPH oxydase (NOX2) des phagocytes, indispensable à l’assemblage et à l’activation, dépendants d’un stimulus, de la production de superoxyde. Après phosphorylation, p47phox se transloque vers les membranes et coordonne les interactions entre p67phox, p40phox et le cytochrome b558 membranaire (gp91phox/NOX2 et p22phox), permettant la génération d’espèces réactives de l’oxygène au cours des réponses immunitaires innées. Cette explosion oxydative soutient la défense antimicrobienne, la signalisation redox et la modulation des voies inflammatoires, reliant l’activité de NCF1 au fonctionnement des neutrophiles et des macrophages. Une altération de la fonction de NCF1/p47phox est associée à des phénotypes d’immunodéficience tels que la granulomatose septique chronique et a été étudiée dans le contexte d’une inflammation dérégulée et de l’auto-immunité.

p47phox Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NCF1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

p47phox Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NCF1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NCF1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de p47phox. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NCF1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de p47phox au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie p47phox dans les cellules tumorales présentant une expression de NCF1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.