Plasmide CRISPR d'Activation (h) p16-ARC: sc-403469-ACT

ARPC5 humain code p16-ARC, une sous-unité centrale du complexe Arp2/3, qui nucléé des filaments d’actine ramifiés afin de contrôler la formation des lamellipodes, la polarité cellulaire, l’endocytose et le trafic vésiculaire. En régulant le remodelage de l’actine en aval des GTPases de la famille Rho, l’activité d’Arp2/3 coordonne le renouvellement des adhérences et la migration directionnelle, modulant la dynamique du cytosquelette lors de la prolifération et de la différenciation. Des altérations de la fonction du complexe Arp2/3 et de l’organisation du réseau d’actine ont été associées à des phénotypes invasifs et à un comportement métastatique dans de multiples contextes cancéreux, ainsi qu’à des défauts plus larges du trafic membranaire et de la motilité des cellules immunitaires. ARPC5 constitue donc un nœud pertinent pour étudier la signalisation dépendante du cytosquelette, la mécanotransduction et les changements de motilité cellulaire induits par le microenvironnement.

p16-ARC Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ARPC5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

p16-ARC Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ARPC5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ARPC5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de p16-ARC. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ARPC5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de p16-ARC au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie p16-ARC dans les cellules tumorales présentant une expression de ARPC5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.