Plasmide CRISPR d'Activation (h) p107: sc-400779-ACT

Le gène humain **RBL1** code la protéine apparentée au rétinoblastome **p107**, une protéine « pocket » qui freine la progression du cycle cellulaire en se liant aux facteurs de transcription **E2F** et en coordonnant la répression des gènes nécessaires à l’entrée en phase S. p107 intègre les signaux provenant de l’activité des kinases dépendantes des cyclines et participe aux voies RB/E2F ainsi qu’aux voies associées aux points de contrôle, qui relient les signaux prolifératifs au contrôle transcriptionnel. Par ses interactions avec les régulateurs de la chromatine et les programmes de réplication de l’ADN, p107 contribue au maintien de la stabilité génomique et des états de différenciation. Une activité altérée de la voie RBL1 est associée à une prolifération dérégulée et est fréquemment étudiée dans le contexte du contrôle oncogénique du cycle cellulaire et des perturbations des réseaux suppresseurs de tumeurs.

p107 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RBL1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

p107 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RBL1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RBL1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de p107. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RBL1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de p107 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie p107 dans les cellules tumorales présentant une expression de RBL1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.