OTUD4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-412322-ACT

OTUD4 codifica uma desubiquitinase humana contendo domínio de tumor ovariano que regula a degradação e a sinalização proteicas dependentes de ubiquitina, removendo cadeias de ubiquitina de proteínas substrato. Ao modular a dinâmica da ubiquitinação, OTUD4 influencia a proteostase, vias de resposta ao estresse e o controlo dependente do contexto da sinalização imunitária inata e inflamatória. Alterações na atividade de OTUD4 têm sido associadas na literatura a redes desreguladas de sinalização por ubiquitina que se cruzam com a estabilidade do genoma e decisões de destino celular, tornando-a relevante para estudos mecanísticos em biologia do cancro e neurobiologia. O seu papel enzimático na desubiquitinação também posiciona OTUD4 como um nó útil para dissecar a comunicação cruzada entre a remodelação da ubiquitina e programas transcricionais.

OTUD4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de OTUD4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

OTUD4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus OTUD4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição OTUD4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de OTUD4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus OTUD4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de OTUD4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via OTUD4 em células tumorais com expressão de OTUD4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.