OLFML3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404425-ACT

OLFML3 (olfactomedin-like 3) codifica uma glicoproteína secretada associada à matriz extracelular, implicada na remodelação do microambiente tecidual e na regulação das interações célula–matriz. Em células humanas, a OLFML3 tem sido associada a vias que controlam a sinalização angiogénica, a adesão celular e a comunicação entre estroma e sistema imunitário, com funções descritas no desenvolvimento vascular e na organização da matriz extracelular. Alterações na expressão de OLFML3 foram observadas em múltiplos contextos de doença, incluindo estroma associado ao cancro e cenários inflamatórios, o que sustenta a sua utilidade como um nó mecanístico para estudar fenótipos impulsionados pelo microambiente. A modulação experimental de OLFML3 é, portanto, relevante para investigar como reguladores secretados da MEC influenciam a migração, o comportamento endotelial e redes de sinalização em culturas complexas e sistemas de co-cultura.

OLFML3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de OLFML3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

OLFML3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus OLFML3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição OLFML3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de OLFML3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus OLFML3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de OLFML3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via OLFML3 em células tumorais com expressão de OLFML3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.