NPRL2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402875-ACT

Humanes NPRL2 kodiert eine zentrale Komponente des GATOR1-Komplexes, eines wichtigen negativen Regulators der mTORC1-Signalübertragung, der die Verfügbarkeit von Aminosäuren mit der Kontrolle des zellulären Wachstums verknüpft. Indem NPRL2 die Drosselung der mTORC1-Aktivität fördert, unterstützt es Nährstoffstress‑Antworten, die Regulation der Autophagie und die metabolische Homöostase und beeinflusst damit die Proteinsynthese sowie den Zellzyklusverlauf. Eine veränderte Expression oder Funktion von NPRL2 wurde mit einer fehlregulierten mTOR‑Signalwegaktivität in unterschiedlichen Kontexten von aberranter Proliferation und Stressanpassung in Verbindung gebracht, was NPRL2 für mechanistische Studien der Wachstumskontrolle relevant macht. NPRL2 wird außerdem als Knotenpunkt genutzt, um Nährstoffsensorik‑Schaltkreise und nachgeschaltete Transkriptionsprogramme zu untersuchen, die das zelluläre Überleben und die biosynthetische Kapazität prägen.

NPRL2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NPRL2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NPRL2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NPRL2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NPRL2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NPRL2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NPRL2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NPRL2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NPRL2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NPRL2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.