Plasmide CRISPR d'Activation (h) NPC2: sc-402010-ACT

Le gène humain **NPC2** code une protéine lysosomale soluble capable de lier le cholestérol, qui coopère avec **NPC1** pour mobiliser le cholestérol non estérifié et d’autres lipides depuis les endosomes tardifs/lysosomes vers des voies de trafic intracellulaire en aval. L’activité de NPC2 soutient l’homéostasie des stérols, la composition membranaire et la signalisation dépendante des lipides en régulant la sortie du cholestérol et sa distribution vers le réticulum endoplasmique et la membrane plasmique. La perturbation du transport dépendant de NPC2 entraîne une accumulation lipidique lysosomale et altère la fonction endolysosomale, ce qui relie NPC2 à la maladie de Niemann-Pick de type C2 ainsi qu’à des voies plus larges impliquées dans la neurodégénérescence et les dysfonctionnements métaboliques. En tant que composant central du trafic intracellulaire des lipides, NPC2 est fréquemment étudiée dans les mécanismes régissant la dynamique autophagie–lysosome, le transport vésiculaire et les programmes d’expression génique régulés par le cholestérol.

NPC2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NPC2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NPC2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NPC2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NPC2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NPC2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NPC2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NPC2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NPC2 dans les cellules tumorales présentant une expression de NPC2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.