Plasmide CRISPR d'Activation (h) NOXA: sc-400498-ACT

PMAIP1 code pour NOXA, un membre pro-apoptotique « BH3-only » de la famille BCL2, qui favorise la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale en antagonisant préférentiellement MCL1 et des protéines anti-apoptotiques apparentées. NOXA est rapidement induite par des signaux de stress cellulaire, notamment les réponses aux dommages de l’ADN dépendantes de p53, et fait le lien entre l’apoptose, la protéostase et la signalisation associée à l’hypoxie. En déplaçant l’équilibre des interactions au sein de la famille BCL2, NOXA influence l’activation des caspases, l’intégrité mitochondriale et les décisions de destinée cellulaire. Une expression dérégulée de PMAIP1/NOXA a été associée à une modification de l’amorçage apoptotique en biologie des cancers, ainsi qu’à des phénotypes de réponse au stress pertinents pour la neurodégénérescence et les contextes inflammatoires.

NOXA Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PMAIP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NOXA Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PMAIP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PMAIP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NOXA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PMAIP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NOXA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NOXA dans les cellules tumorales présentant une expression de PMAIP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.