Plasmide CRISPR d'Activation (r) Nox4: sc-437338-ACT

La NADPH oxydase 4 (Nox4) est un flavocytochrome associé à la membrane qui génère des espèces réactives de l’oxygène, principalement du peroxyde d’hydrogène, dans le cadre d’une signalisation rédox régulée dans les cellules de rat. Les ERO dérivées de Nox4 influencent des voies qui contrôlent la prolifération, la différenciation, le remodelage du cytosquelette et le renouvellement de la matrice extracellulaire, avec des effets en aval sur la signalisation MAPK, les réponses au TGF-β et les programmes transcriptionnels associés à l’hypoxie. Une activité NOX4 altérée a été liée à des phénotypes de stress oxydant pertinents pour la fibrose, la dysfonction vasculaire, les lésions rénales et la signalisation inflammatoire, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques du remodelage cellulaire dépendant du rédox. Comme NOX4 peut être constitutivement active dans certains contextes, la modulation de son expression est souvent utilisée pour analyser comment une production soutenue d’ERO remodèle les réseaux de signalisation.

Nox4 Le plasmide d'activation CRISPR (r) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Nox4 Le plasmide d'activation CRISPR (r) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription , où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Nox4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Nox4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Nox4 dans les cellules tumorales présentant une expression de silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.