Plasmide CRISPR d'Activation (h) Notch 3: sc-400424-ACT

NOTCH3 code Notch 3, un récepteur transmembranaire à passage unique qui assure une signalisation Notch juxtacrine en réponse aux ligands de type Delta et Jagged. Après la liaison du ligand, un clivage protéolytique libère le domaine intracellulaire de Notch, qui se transloque au noyau et coopère avec RBPJ/CSL et des coactivateurs pour réguler des programmes transcriptionnels contrôlant la spécification du destin cellulaire, la différenciation et l’homéostasie tissulaire. L’activité de Notch 3 est étroitement liée à la biologie des cellules musculaires lisses vasculaires et, plus largement, aux réseaux de signalisation du développement ; une dérégulation de la transcription dépendante de NOTCH3 a été associée à des artériopathies héréditaires ainsi qu’à des contextes oncogéniques. En tant que nœud de voie, NOTCH3 constitue un modèle exploitable pour disséquer la dynamique d’activation du récepteur, la sortie transcriptionnelle et les interactions (crosstalk) avec les processus liés à MAPK, PI3K-AKT et TGF-β.

Notch 3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NOTCH3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Notch 3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NOTCH3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NOTCH3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Notch 3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NOTCH3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Notch 3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Notch 3 dans les cellules tumorales présentant une expression de NOTCH3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.